当前位置：首页 > 详细信息 上海噬菌体与耐药研究所秦金红团队报道了一例针对肺炎克雷伯菌感染的个性化噬菌体治疗案例
作者：CZRC 发布时间：2023/9/8 9:00:00
以下文章来源于上海噬菌体与耐药研究所 ，作者李建辉
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一种常见的机会致病菌，存在于鼻、喉、皮肤和肠道菌群中。它可造成免疫力低下的患者多部位感染，包括呼吸道、尿路、软组织、手术伤口和血流等。肺炎克雷伯菌易获得转移遗传元件、具备突变能力，这些特性使其对抗菌药物容易产生耐药性。多耐药肺炎克雷伯菌引起的肺部感染会导致抗生素治疗时间延长、手术延误和死亡率增加，对公共卫生安全构成了严重威胁。
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一种常见的机会致病菌，存在于鼻、喉、皮肤和肠道菌群中。它可造成免疫力低下的患者多部位感染，包括呼吸道、尿路、软组织、手术伤口和血流等。肺炎克雷伯菌易获得转移遗传元件、具备突变能力，这些特性使其对抗菌药物容易产生耐药性。多耐药肺炎克雷伯菌引起的肺部感染会导致抗生素治疗时间延长、手术延误和死亡率增加，对公共卫生安全构成了严重威胁。
噬菌体具有与抗生素不同的杀菌机制，有望替代抗生素治疗感染。它感染细菌后会在细菌内复制，导致细菌死亡，释放的子代又感染其他细菌，这种动态的生命周期构成了噬菌体治疗的理论基础。噬菌体和它们的宿主细菌在环境中又存在共同进化。为了确保生存，细菌在噬菌体进入时和复制过程中可以采用多种强大的防御机制来抵御攻击，包括受体蛋白突变、限制性修饰、CRISPR-Cas系统、流产感染等。细菌表面受体的自发突变可以阻止噬菌体吸附并将其DNA注射到细菌中，这是驱动噬菌体耐受和噬菌体-细菌共同进化的最常见机制。细菌-噬菌体相互作用很大程度上依赖于外膜蛋白、脂多糖、荚膜多糖、鞭毛和其他表面结构，这些结构通常有利于抗生素耐药和细菌毒力，因此噬菌体抗性、细菌受体的突变会导致其致病力下降。尽管近年来有许多噬菌体治疗多耐药细菌感染的成功案例，但由于细菌易产生噬菌体抗性，噬菌体治疗的临床结果仍不可预测。上海噬菌体与耐药研究所自2018年起开启我国第一个噬菌体治疗临床试验，目前已成功治疗了肺部感染（Microb Biotechnol. 2023;16(4):862-867.）、泌尿系统感染（Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):771-774.、Front Cell Infect Microbiol. 2021;10:608402.）、COVID-19继发的耐药菌感染（Emerg Microbes Infect. 2021;10(1):612-618.）等超100例，这些成功的案例让人们看到了噬菌体治疗的未来。
2023年8月29日，上海市公共卫生临床中心上海噬菌体与耐药研究所研究团队在传染病领域权威期刊Clinical Microbiology and Infection上在线发表题为“ Development of phage resistance in multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae is associated with reduced virulence: A case report of a personalised phage therapy ” 的研究论文。该论文报道了一例针对肺炎克雷伯菌感染的个性化噬菌体治疗案例，该疗法对患者的肺炎克雷伯菌感染有一定的治疗效果，虽然细菌最终没有被完全清除，但患者的临床症状明显好转。通过进一步实验验证，噬菌体治疗后，肺炎克雷伯菌产生了噬菌体抗性，而与之对应的细菌致病力降低。该案例表明，即便细菌因产生噬菌体抗性而无法完全被清除，噬菌体治疗仍可使患者受益。
该研究报道的是一位54岁男性患者，患者在一次车祸后，处于昏迷状态、多处骨折，肺部感染多耐药肺炎克雷伯菌。尽管进行了抗生素治疗，肺炎克雷伯菌感染持续存在。经过2个疗程的肺部雾化噬菌体（ΦKp_GWPA139和ΦKp_GWPB35）治疗，他的肺部感染症状明显改善（CT结果显示炎症和胸腔积液均减少），随后他接受了手术治疗。然而，尽管进行了噬菌体治疗，患者的痰培养表明肺炎克雷伯菌尚未完全清除。实验表明，治疗后分离的肺炎克雷伯菌产生了噬菌体抗性。
研究人员将治疗前后分离的肺炎克雷伯菌进行测序、通过治疗后菌株Kp0829、Kp1383与治疗前菌株Kp7450的基因组进行比对后发现，fabF基因在Kp0829、Kp1383菌株中存在12 bp缺失，而治疗前菌株Kp7450、Kp0140、Kp0222中均不存在该缺失。在对Kp7450菌株中的fabF基因进行敲除后（ΔfabF），Kp7450ΔfabF对治疗用的两种噬菌体产生了抗性。在原本产生了噬菌体抗性的Kp1383菌株中回补该基因，这株噬菌体抗性菌又重新对噬菌体敏感。噬菌体ΦKp_GWPB35的吸附实验也显示，与Kp7450相比，Kp1383和Kp7450ΔfabF的噬菌体吸附率明显降低。以上结果均表明，fabF基因参与了该肺炎克雷伯菌对噬菌体耐受的发展。
图1 fabF 基因突变介导噬菌体抗性菌的产生
图1 fabF 基因突变介导噬菌体抗性菌的产生
有研究表明LPS合成与磷脂生物合成途径存在联系，LPS合成通路LpxK的催化活化依赖于不饱和脂肪酸，fabF基因能够调控不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的平衡（PNAS. 2016; 113(11): 3108-3113.）。为了证实LPS改变是导致噬菌体抗性产生的原因，并研究LPS结构改变对噬菌体吸附的影响，研究人员敲除了两个额外的基因（wabG和waaL），这些基因参与肺炎克雷伯菌LPS生物合成途径。Kp7450ΔwaaL和Kp7450ΔwabG均对ΦKp_GWPA139和ΦKp_GWPB35耐受，而Kp7450ΔwabG也对ΦKp_GWPR59耐受。将不同细菌的LPS抽提并进行电泳、银染，结果发现噬菌体敏感菌株Kp7450、Kp0140和Kp0222的LPS条带类似，但与噬菌体抗性菌Kp0829、Kp1383、Kp7450ΔfabF和Kp7450ΔwaaL不同。研究人员还检测了细菌表面成分破坏后对噬菌体的敏感性。Kp7450在高碘酸盐处理下，噬菌体吸附显著减少，但在蛋白酶K处理下，没有观察到变化。由于高碘酸盐破坏多糖如LPS的结构，而蛋白酶K破坏外膜蛋白，因此研究人员得出结论，LPS是该治疗所用噬菌体的吸附受体。
最后，研究人员用两种动物模型，BALB/c小鼠、斑马鱼（Danio rerio），评估了噬菌体敏感菌Kp7450和噬菌体抗性菌Kp1383、Kp7450ΔfabF的致病力。在小鼠中，Kp7450半致死剂量、脏器（肝、肺、脾）细菌载量均高于Kp1383和Kp7450ΔfabF。在斑马鱼模型中，将绿色荧光标记的肺炎克雷伯菌通过显微注射至3 dpf幼鱼血循环系统造成系统性感染，绿色荧光量随感染时间不断增加，说明肺炎克雷伯菌能够在幼鱼体内增殖造成死亡。生存曲线显示噬菌体敏感菌Kp7450、Kp0140和Kp0222感染后第7天幼鱼生存率降至约20%，而噬菌体耐受菌Kp0829、Kp1383和Kp7450ΔfabF生存率维持在约70%。同期，对不同感染时间的幼鱼体内细菌载量进行计数，结果显示在相同感染时间（第4、6天）情况下，Kp7450、Kp0140和Kp0222增殖量明显高于Kp0829、Kp1383和Kp7450ΔfabF。上述斑马鱼模型结果说明噬菌体抗性菌Kp0829、Kp1383和Kp7450ΔfabF的致病力减弱，与小鼠结果一致；也反映了斑马鱼可替代小鼠，作为检测肺炎克雷伯菌致病力变化的模型之一。后续开展大规模测定细菌致病力变化时，斑马鱼模型有小鼠不可替代的优势：成本低、易获得、操作简便等。
图2 不同肺炎克雷伯菌对斑马鱼的致病力比较
图2 不同肺炎克雷伯菌对斑马鱼的致病力比较
综上，该案例表明，噬菌体治疗虽然在短期内降低了肺部细菌载量，但噬菌体抗性菌快速出现、无法完全清除。后续的实验结果显示，肺炎克雷伯菌通过fabF基因部分缺失改变了LPS结构，从而对治疗所用噬菌体产生了耐受。噬菌体抗性菌的出现是噬菌体治疗的一个挑战，噬菌体鸡尾酒在抗性菌产生方面由于使用单一噬菌体。虽然本案例使用两种噬菌体，但无法避免抗性菌的快速产生。因此理想的噬菌体鸡尾酒应是针对不同受体的组合，深入了解噬菌体受体的功能和类型，可以为临床合理设计噬菌体鸡尾酒提供可靠的依据。
上海市公共卫生临床中心上海噬菌体与耐药研究所李建辉技术员为该论文的第一作者，上海市公共卫生临床中心上海噬菌体与耐药研究所、上海交通大学医学院免疫学与微生物学系秦金红教授和复旦大学附属中山医院，上海市器官移植重点实验室朱同玉教授为该论文的共同通讯作者。该工作得到了上海市公共卫生临床中心结核病研究中心、斑马鱼实验平台晏博副研究员的大力支持。该研究得到了国家自然科学基金、上海市申康医院发展中心、上海市科学技术委员会和上海市金山区科学技术委员会等项目资助。